Make your own free website on Tripod.com

Polymerase Chain Reaction ( PCR )

HOME

วิวัฒนาการของ PCR Technology ( Process on PCR Technology : An Overview )
เครื่องอัตโนมัติควบคุมปฏิกิริยา PCR ( PCR Automation)
การออกแบบ Primers และ Probes
เอนไซม์ Thermostable DNA Polymerase
เทคนิคการตรวจวิเคราะห์ผลิตผล PCR ขั้นพื้นฐาน
การศึกษา Genetic Mapping โดย STS - PCR

เทคนิค  PCR  กับมิติใหม่ทางเทคนิคการแพทย์
PCR เพื่อการพิสูจน์หลักฐาน และโบราณคดี  ( PCR in Forensic Science )
การวินิจฉัยโรคไวรัสของพืชโดยเทคนิค PCR ( Plant Virus Diagnosis by PCR )
Real Time PCR

 

                                        

 

 

วิวัฒนาการของ PCR Technology

Process on PCR Technology : An Overview

 

ตั้งแต่ ปีค.ศ.1896-1985 นับได้ว่าเป็นยุคแรกของอณูชีววิทยา ตลอดระยะเวลา 116 ปีที่ผ่านมานั้น การค้นพบวิทยาการความรู้ใหม่ๆ เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องเป็นลำดับ ผลงานสำคัญที่นำมาสู่ความเจริญก้าวหน้าในยุคปัจจุบัน มีดังนี้

                ค.ศ. 1869 พระชาวออสเตรเลียชื่อ Gregor Mendel ศึกษาการผสมพันธุ์ของต้นถั่ว ทำให้สามารถอธิบายกลไกทางพันธุกรรม

                ค.ศ.1944 O.T. Avery และคณะ แห่งมหาวิยาลัย Rockefeller ศึกษาแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคปอดบวม ทำให้ค้นพบว่ายีน ประกอบด้วย DNA

                ค.ศ. 1953 Francis H.C. Crick และ James D. Watson ค้นพบโครงสร้างของ DNA เป็น Double Helix

                ค.ศ. 1965 การสังเคราะห์โปรตีนทำได้ในหลอดทดลอง  ทำให้มีความรู้เรื่อง รหัสพันธุกรรม

 (Genetic Code)

                ค.ศ. 1970 Hamilton Smith และ Daniel Nathans ค้นพบและสามารถใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ ที่ตัดและแยกโมเลกุลของ DNA ได้

                ค.ศ 1972 Paul Berg และคณะ สามารถเชื่อมDNA ของไวรัส 2 ชนิด ทำให้ได้ DNA ลูกผสม

                ค.ศ. 1973 Stanley Cohen สามารถสอดใส่ Recombinent  DNA เข้าไปในแบคทีเรีย นับว่าเป็นการเริ่มต้นของพันธุวิศวกรรม

                ค.ศ. 1977 Walter Gilbert ค้นพบเทคนิคการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุล DNA
 

                ยุคที่สองของอณูชีววิทยา เริ่มต้นเมื่อเดือนตุลาคม ปีค.ศ. 1985 โดย Saki และคณะของบริษัท Cetus Corporation ได้เสนอผลงานการค้นพบ Polymerase Chain Reaction (PCR)

                Polymerase Chain Reaction (PCR)  อาศัยหลักการของการเกิด DNA Replication โดยทำให้เกิดในหลอดทดลอง แบบซ้ำๆกันหลายรอบ ในช่วงเริ่มแรกของเทคนิค PCR ใช้เอนไซม์ Klenow Fragment ปฏิกิริยาแต่ละรอบของ PCR มี 3 ขั้นตอนได้แก่

1.       Denaturation ทำให้ DNA สายคู่ แยกจากกันเป็นสายเดี่ยว เกิดที่อุณหภูมิสูงประมาณ 90°C- 95°C

2.       Primer annealing primers 2 สาย เข้าไปจับคู่สมบน DNA สายเดี่ยวที่เป็นแม่พิมพ์ (Template) เกิดที่อุณหภูมิประมาณ 40 °C -  60 °C

3.       Primer extension การต่อลำดับนิวคลีโอไทด์ เข้าที่ปลาย 3 –OH ของ primer โดยใช้เอนไซม์ Klenow Fragment ซึ่งต้องการอุณหภูมิพอเหมาะที่ 30 °C

PCR ที่พัฒนาได้ในช่วงเริ่มต้นแม้ว่าจะมีข้อดีในด้านเป็นเทคนิคที่มีศักยภาพสูง สามารถเพิ่มขยายขนาดจำนวน DNA ในหลอดทดลองได้ง่าย

 และรวดเร็วแต่เทคนิค PCR ก็มีข้อด้อยที่สำคัญหลายประการ ได้แก่

     1.       เอนไซม์ Klenow Fragment ที่ใช้ในปฏิกิริยา PCR นั้น ไม่ทนต่อความร้อน ในทุกขั้นตอนของ Denaturation ที่อุณหภูมิสูง  เอนไซม์จะสูญเสียสภาพธรรมชาติไม่สามารถเร่งปฏิกิริยาได้ จึงต้องเติมเอนไซม์ใหม่ลงไปในขั้นตอน

     2.       การควบคุมอุณหภูมิของ 3 ขั้นตอน ในปฏิกิริยา PCR นั้น เริ่มแรกใช้วิธีการทำด้วยมือ ( Manual Method) โดยใช้อ่างน้ำ หรือ Heat Block 3 อัน เพื่อตั้ง 3 อุณหภูมิตามที่กำหนดในแต่ละขั้นตอนจะมีคนคอยหยิบหลอดปฏิกิริยาให้เปลี่ยนตามอุณหภูมิ นับว่าเสียเวลามากที่สุด

     3.       DNA Template ในปฏิกิริยา PCR จะต้องทราบลำดับนิวคลิโอไทด์ที่ถูกต้องเพื่อจะได้ใช้ข้อมูลมาออกแบบคู่ Primer ที่เหมาะสม จะไม่สามารถเพิ่มขยาย DNA ที่ไม่ทราบข้อมูลลำดับนิวคลิโอไทด์ได้

     4.       มีอุปสรรคการเพิ่มขยายจำนวน DNA Template ที่มี Secondary Structure ซึ่งต้องการสภาวะพอเหมาะในขั้นตอน Denature ที่มีอุณหภูมิสูงขึ้น จึงต้องการเอนไซม์ DNA Polymerase ที่ทนความร้อนสูงๆได้

     5.       การออกแบบคู่ Primers เป็นขั้นตอนที่ยุ่งยากและใช้เวลามาก

     6.       เพิ่มขยายขนาดได้เฉพาะ DNA แต่ไม่สามารถเพิ่มขยายจำนวน RNA ได้ทำให้มีข้อกำจัดในการประยุกต์ใช้ประโยชน์

     7.       ไม่สามารถขยายจำนวน DNA พร้อมกันของหลาย DNA Template ในปฏิกิริยาเดียวกัน

     8.       ประสิทธิภาพของปฏิกิริยา PCR ที่ใช้ Primer 1 คู่ มีข้อจำกัดในกรณีที่มี DNA Template เริ่มต้นจำนวน Copies น้อยๆ

     9.       ปฏิกิริยา PCR มีปัญหาต่อการเพิ่มขยาย DNA Template ที่มี Stable Hairpinloop Structure , Base Compressions และจำนวน G+C สูง

     10.    ปัญหาการปนเปื้อนและการเกิด Carry-Over  มักเกิดขึ้นเสมอในปฏิกิริยา PCR ทำให้เกิดผลบวกปลอมได้ง่าย
 

ปัญหาและอุปสรรคของเทคนิค   PCR   ดังกล่าวเป็นแรงผลักดันที่ก่อให้เกิดการพัฒนาวิทยาการหลายๆเพื่อแก้ไขหรือลดปัญหาและอุปสรรคเหล่านั้นปรับปรุงประสิทธิภาพและการพัฒนาดัดแปลงเทคนิค  PCR   วิวัฒนาการของ   PCR  Technology
 

                1. เอนไซม์  DNA  Polymerases

                    การค้นพบเอ็นไซม์  DNA Polymerases  ชนิดที่ทนความร้อนสูงได้ ( Thermostable  DNA  Polymerase)แยกสกัด Thermophilic  Bacteria  Thermus aquaticus(Taq)ทำให้ได้เอ็นไซม์  Taq DNA Polymerase  ที่นำมาใช้ในปฏิกิริยา  PCR  แทนที่การใช้เอ็มไซม์  Klenow  Fragment  ริเริ่มนำเอ็นไซม์  Taq  DNA  Polymerase  มาใช้ในปฏิกริยา  PCR  โดยแยกสกัดจากแบคทีเรียในรูปของเอ็มไซม์ธรรมชาติต่อมาจึงพัฒนาการสังเคราะห์เอ็นไซม์  Taq  DNA  Polymerase   โดย   Recombinant  DNA  Technology  ทำให้ได้เอ็นไซม์ที่มีค่าแอคทิวิตี้สูงขึ้น

                    เอ็นไซม์ที่แยกสกัดได้จากแบคทีเรีย  Phyrococcus  sp.  บริเวณรอยแยกใต้ทะเลลึกสามารถทนความร้อนได้สูงถึง 104 °C  มีประโยชน์ในปฏิกริยา   PCR  สำหรับวิทยาการคือการค้นพบ  Stoffel  fragment  ที่สามารถแสดง

แอคทิวิตี้ได้ดีในช่วงกว้างของความเข้มข้น Mg2+ และการสังเคราะห์  rTh  DNA  Polymerase โดย Recombinant  DNA  Technology  ที่ทนความร้อนสูง  Reverse  Transcriptase  สภาวะที่มี Mn2+และเป็น  DNA  Polymerase  ในสภาวะที่มี  Mg2+
 

2. เครื่องอัตโนมัติควบคุมปฏิกิริยา PCR ( PCR Automation)

ในช่วงแรกที่ใช้เอนไซม์ Klenow Fragment ในเทคนิค PCR นั้น มีการพัฒนาเครื่องอัตโนมัติ ชื่อว่า

Mr. Cycle ซึ่งดัดแปลงมาจากเครื่อง PRO/Pette Liquid Handler ลักษณะเครื่องมีความยุ่งยากมาก ต่อมาได้เปลี่ยนใช้เอนไซม์ Taq DNA Polymerase ที่สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงได้ทำให้การพัฒนาเครื่องอัตโนมัติทำได้ง่ายขึ้น แบ่งเครื่องอัตโนมัติสำหรับควบคุม PCR แบ่งตามการทำงานได้ 6 ระบบดังนี้

1)      เครื่องอัตโนมัติที่ใช้ Heater ทำความร้อน และใช้ระบบ Air - Compresser ให้ความเย็น

 

รูปที่ 1 DNA Thermo Cycler

 

    2)      เครื่องอัตโนมัติที่ใช้ Heater ทำความร้อน และระบายความร้อนด้วยน้ำประปาหรือระบบทำน้ำเย็นมาต่อเพิ่มเติม

    3)      เครื่องอัตโนมัติที่ใช้ระบบ Peltier ในการควบคุมอุณหภูมิ

 

รูปที่ 2 PTC-100

 

 

4)      เครื่องอัตโนมัติที่มีโครงสร้างการทำงานแบบตู้อบควบคุมอุณหภูมิ

 

รูปที่ 3  BioThrem BioOven

 

5)      เครื่องอัตโนมัติที่ใช้หลอดไฟทำความร้อนและระบายความร้อนด้วยพัดลม

6)      เครื่องอัตโนมัติที่ใช้อากาศเป็นตัวส่งผ่านความร้อนและความเย็น
 

3. การออกแบบ Primers และ Probes

ปัจจุบันมีการใช้คอมพิวเตอร์มาช่วยออกแบบ Primers และ Probes ซึ่งสามารถช่วยอำนวยความสะดวก และลดเวลาในการออกแบบและเลือก Primers กับ Probes ที่ต้องการ โดยทั่วไปสามารถทำได้ 2 วิธีคือ

        1) ใช้คอมพิวเตอร์เพื่อวิเคราะห์ข้อมูลที่มีประโยชน์ต่างๆ

        2) เลือกใช้ Software สำเร็จรูปที่เป็น Automatic Primer - Probe Design Program มีจำหน่ายมากมายให้เลือกใช้

เทคนิค PCR

                การพัฒนาเทคนิคนี้เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องและรวดเร็วตามวัตถุประสงค์ของงานวิจัย การดัดแปลงจากเทคนิค PCR พื้นฐานก่อให้เกิดเทคนิคชั้นสูงจำนวนมาก ซึ่งสามารถช่วยเพิ่มประสิทธิภาพและลดปัญหาอุปสรรคต่างๆของปฏิกิริยา PCR

                เทคนิคชั้นสูงที่สำคัญ ได้แก่

                                Booster PCR

                                Asymmetric PCR

                                Nested PCR

                                ฯลฯ

                แต่ละเทคนิคมีหลักการและประโยชน์ในการประยุกต์ใช้แตกต่างกัน
 

4. การเกิด  PCR   Product  Carry - Over

                วิธีการป้องกันไม่ให้เกิดการปนเปื้อนจากผลิตผลของ PCR จากหลอดหนึ่งข้ามไปอีกหลอดหนึ่ง

 ( PCR Product Carry - Over) ในปัจจุบันนิยมกำหนดมาตรการเป็น 2 ระดับคือ

1)   การป้องกันก่อนทำปฏิกิริยา PCR ซึ่งมีหลายวิธีได้แก่

                               การใช้แสงอุลตราไวโอเลต

                               การใช้รังสีแกมม่า

                               การใช้เอนไซม์ Uracil  DNA  Glycosylase

2)   การป้องกันหลังปฏิกิริยา PCR ใช้ขบวนการ Photochemical Reaction ไปทำให้ผลิตผลของ PCR สูญเสียสภาพการเป็นแม่พิมพ์สารเคมีที่นิยมใช้จัดอยู่ในกลุ่ม Furocoumarines

 

ประโยชน์ของเทคนิค PCR ที่นำมาใช้ในปัจจุบัน

1.       ประโยชน์ในการศึกษาวิจัย เช่น

                          DNA Sequencing

                          Molecular Cloning

                          ฯลฯ

2.       ประโยชน์ทางการแพทย์และนิติเวช ใช้ในการชันสูตรโรคและพิสูจน์หลักฐานในการดำเนินคดี เช่น HLA Typing ฯลฯ

 

                 

 

รูปที่ 4 แสดงกระบวนการของ PCR ขั้นพื้นฐาน

 

HOME

 

 

เอนไซม์ Thermostable DNA Polymerase

 

            การเพิ่มปริมาณยีนในหลอดทดลองโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) เพิ่มปริมาณ DNA เฉพาะบริเวณที่ต้องการทำการศึกษาให้มีปริมาณสูงกว่าเดิมหลายล้านเท่า มาใช้เป็นครั้งแรกในปี ค.ศ. 1985 โดย  Saiki  และคณะ  ได้ทำการเพิ่มปริมาณยีนเฉพาะบริเวณในเบต้า-โกลบินยีน จาก DNA  ที่สกัดจากเม็ดเลือดขาวของคนไข้โรค Sickle Cell Anemia ปฏิกิริยาแต่ละรอบประกอบด้วย 3 ขั้นตอน ขั้นตอนแรกเป็นการให้ความร้อนแก่สารละลาย DNA Polymerase 90 - 95 °C) เพื่อให้ DNA เกลียวคู่คลายเกลียวออกเป็นสายเดี่ยว ( Denaturation ) ขั้นที่สอง เป็นการลดอุณหภูมิลงมาให้เหมาะสมสำหรับการจับกันระหว่าง primer ซึ่งเป็น DNA สายสั้น มีลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะกับบริเวณของ DNA ที่ต้องการทำการศึกษากับDNAสายเดี่ยว ( Primer Annealing)  ขั้นที่สามเป็นการเติมเอนไซม์ลงไปและปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมกับการทำงานของเอนไซม์ เพื่อให้เกิดการสร้าง DNA   ทดลองสามารถเพิ่มปริมาณ DNA เฉพาะสายมีความยาว 110 คู่เบสได้ปริมาณเพิ่มขึ้นจากเดิม 220,000 เท่า  ข้อด้อย ในขั้นที่ 2 และ 3 ปรับอุณหภูมิมาที่ 30°C เพื่อให้ Primer จับที่ DNA เพื่อให้เอนไซม์ สามารถเร่งปฎิกิริยาได้ที่อุณหภูมินี้ Primer จับกับบริเวณอื่น ๆ ที่ไม่จำเพาะได้อีกด้วย เพราะอุณหภูมิต่ำเกินค่าอุณหภูมิจำเพาะของการจับคู่เบส ขั้นตอนแรก เพิ่มอุณหภูมิให้กับสารละลายถึง 95°C เป็นเวลา 5 นาที เพื่อให้ DNA คลายเกลียวแยกเป็นสายเดี่ยวใหม่อีกครั้งหนึ่ง เอนไซม์ DNA Polymerase  เสียสภาพ จึงต้องเติมเอนไซม์ใหม่ลงไปในขั้นที่สามของทุกรอบปฏิกิริยา  ไม่สามารถดำเนินปฏิกิริยาต่อเนื่องโดยใช้เครื่องอัตโนมัติได้

                ปรับปรุงเทคนิคโดยใช้การทำงานของเอนไซม์ DNA Polymerase ที่สกัดได้จากแบคทีเรียที่เจริญเติบโตได้ในน้ำพุร้อน( Thermus  aquaticus  DNA Polymerase ) ปรับอุณหภูมิในขั้นตอนที่สองจาก

 30 °C เป็น 54 °C ซึ่งเป็นอุณหภูมิจำเพาะที่ Primer สามารถจับกับDNAเป้าหมาย  และปรับอุณหภูมิในขั้นตอนที่สามเป็น 70 °C เพื่อให้เอนไซม์ทำงานได้ดี ไม่ต้องเติมเอนไซม์ใหม่ลงไปเพราะเอนไซม์นี้มีคุณสมบัติทนต่อความร้อนสูงได้ หลังจากนั้นได้มีการประดิษฐ์เครื่องอัตโนมัติ

                เอนไซม์  DNA Polymerase  เร่งปฎิกิริยาการเชื่อมต่อโมเลกุลของ Deoxyribonucleotides เข้าที่ปลาย 3´ อิสระของสาย DNA ครั้งละหนึ่ง

โมเลกุลดังปฎิกริยา

                                                                                (DNA)n + dNTP     -->     (DNA)n+1 + ppi

                โดยมีลำดับนิวคลีโนไทด์ใน DNA สายเดี่ยวทำหน้าที่เป็นแม่พิมพ์ ( Template ) ปฎิกิริยานี้จึงต้องการ Deoxyribonucleotides ทั้ง4 ชนิด ( dATP , dGTP , dCTP ,และ dTTP )  แมกเนเซียมอิออนเป็น Cofactor และ Primer  การเพิ่มความยาวของ DNA สายใหม่ในทิศทาง 5-3 ปฎิกิริยานี้เรียกว่า ปฎิกิริยาโพลีเมอเรส  เอนไซม์นี้สามารถเร่งปฎิกิริยาได้อีก 2 ประเภท คือ      ปฎิกิริยา 3-5 exonuclease  เป็นปฎิกิริยาอิสระของDNA สายเดี่ยวครั้งละ 1 โมเลกุลในขณะที่มีการสังเคราะห์ DNA สายใหม่นั้น ปฎิกิริยานี้ทำหน้าที่เป็นกลไกป้องกันมิให้เกิดการผ่าเหล่า เนื่องจากมีการนำโมเลกุลของดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ชนิดที่ไม่เป็นคู่สมกับนิวคลีโอไทด์ใน DNA แม่พิมพ์เข้าไปเชื่อมต่อในปฎิกิริยาโพลีเมอเรส กลไก proofreading  การแก้ไขโดยย่อยโมเลกุลดังกล่าวออกไปแล้วนำดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ชนิดที่ภูกต้องเข้ามาเชื่อมต่อ      3’-5’ Exonuclease  ย่อยโมเลกุลดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ออกจากปลาย 5 ของ DNA เกลียวคู่ กลไก่ตรวจและซ่อมแซมบริเวณที่ผิดพลาด ( Error - Correcting ) ของ DNAเกลียวคู่

                การย่อยโมเลกุลของเอนไซม์ DNA Polymerase  ด้วยเอนไซม์ Protease ตัดโมเลกุลของเอนไซม์ออกเป็น 2 ส่วน ส่วนแรกเป็นลูกโซ่ polypeptide  ที่มีขนาด 36 กิโลดาลตัน เป็นส่วนที่มีบริเวณเร่งของปฎิกิริยา 5’-3’ Exonuclease  ส่วนที่สองเป็นลูกโซ่ Polypeptide ขนาด 67 กิโลดาลตันซึ่งมีบริเวณเร่งของปฎิกิริยา Polymerase  และ3-5 Exonuclease  เรียกส่วนนี้ว่า Klenow Fragment

                ต่อมาภายหลังได้มีการแยกสกัดเอนไซม์ DNA Polymerase  อีก 2 ชนิด เรียกเอนไซม์ที่แยกสกัดได้ครั้งแรกว่า  DNA Polymerase I  พบภายหลังเป็น DNA Polymerase II และ III ตามลำดับ ทำหน้าที่แตกต่างกันในเซลล์

                DNA Polymerase ที่สกัดได้จากแบคทีเรียที่เจริญเติบโตได้ในน้ำพุร้อน โมเลกุลเดี่ยวน้ำหนักโมเลกุล 60-68 กิโลดาลตัน ทำหน้าที่เร่งปฎิกิริยา เช่นเดียวกับเอนไซม์ DNA Polymerase I ของ E.coli   สามารถเร่งปฎิกิริยาได้ดีที่อุณหภูมิ  76°C  และจะหยุดที่ 86°C  ไม่มีปฎิกิริยา 3’-5’ Exonuclease จึงไม่มีคุณสมบัติ  Proofreading

 

HOME

 

 

เทคนิคการตรวจวิเคราะห์ผลิตผล PCR ขั้นพื้นฐาน

 

                วิธีการตรวจหา PCR Product กระทำได้หลายวิธี เทคนิคที่ใช้แบ่งออกเป็น 2 เทคนิคใหญ่ๆ คือ

1.       วิธี Gel Electrophoresis

2.       วิธี Nucleic Acid Hybridization
 

Gel Electrophoresis

            คือ การตรวจดูผล PCR Product จากการย้อม DNA ด้วย Ethidium Bromide หลังจากผ่านกระบวนการอิเลคโทรโฟเรซิสแล้ว วิธีนี้เป็นวิธีที่ง่ายและรวดเร็วที่สุดเหมาะสำหรับการจรวจสอบหา PCR Product ที่ทราบขนาดแน่นอน และได้ PCR Product เพียงชนิดเดียวหรือจำนวนน้อยชนิดที่สามารถเห็นความแตกต่างของขนาดได้ชัดเจน หากเป็นชิ้นส่วน DNA ที่มีขนาดกว่า 500 bps นิยมใช้ 1%(w/v) Agarose Gel เป็น Gel ตรวจหา แต่หากเป็น DNA  ที่มีขนาดสั้นกว่า 500 bps นิยมใช้ 2%(w/v) Agarose Gel หรือ 5%(w/v) Acrylamide เป็น Gel ตรวจหา

 

 

รูปที่ 5 แสดงเทคนิคการหยอดตัวอย่างเพื่อทำ Gel Electrophoresis

 

 

รูปที่ 6 แสดงผลที่ได้จากการทำ Gel Electrophoresis

 

 

รูปที่ 7 แสดงภาพรวมของการทำ Gel Electrophoresis
 

Nucleic Acid Hybridization

                คือ วิธีการตรวจหา PCR Product ที่ต้องการในกรณีที่การดูผลจาก Gel ไม่ชัดเจนหรือต้องการเพิ่มความมั่นใจ วิธีการนี้ต้องใช้ตัวติดตามที่มีเบสคู่สม ( Complementary ) กับ PCR Product และจะจับเบสคู่สมกันในสภาวะที่เหมาะสม ตัวติดตามอาจเป็น DNA หรือ RNA ก็ได้ แต่ต้องติดฉลากด้วยสารรังสีหรือสารปลอดรังสี ซึ่งมีการตรวจหาตัวติดตามนั้นอีกครั้ง ในที่นี้จะกล่าวถึงตัวติดตามที่เป็น DNA ที่มีขนาดสั้น หรือที่เรียกว่า Oligonucleotide Probe เท่านั้น

ขั้นตอนการติดตาม PCR Product

1.     การติดฉลาก

1.1    การติดฉลากด้วยสารรังสี

- การติดฉลากที่ปลาย 5´

                                  เนื่องจาก Oligonucleotide สังเคราะห์มีปลาย  5´เป็น OH Group จึงช้คุณสมบัติของเอนไซม์ T4 Polynucleotide Kinase เติม γ-32P-ATP ที่ติดสารรังสีเข้าไปที่  5´-OH Group ของสาย Oligonucleotide ได้ทันที

- การติดฉลากที่ปลาย 3´

                             วิธีการนี้เป็นการติดฉลากสารรังสีเข้าที่ปลาย 3´-OH ของ Oligonucleotide Probe โดยใช้เอนไซม์ Terminal deoxynucleotidyl tranferase ( TdT ) หากต้องการเติมนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากด้วยสารรังสีเข้าที่ปลาย  3´เพียงตัวเดียว เรานิยมใช้ γ-32P dideoxynucleotide triphosphate ( ddNTP ) แทน γ-32P-dNTP แต่หากต้องการเติม Polymer ของนิวตลีโอไทด์เข้าที่ปลาย 3´ก็สามารถใช้  γ-32P-dNTP ได้ อย่างไรก็ตามความยาวของ Homopolymer จะขึ้นกับปริมาณของ dNTP เป็นตัวกำหนด

1.2    การติดฉลากด้วยสารปลอดรังสี

                             สามารถกระทำได้สะดวกและรวดเร็วเช่นเดียวกับการติดฉลากด้วยสารรังสี แต่มีข้อดีตรงที่สารปลอดรังสีปลอดภัยและเก็บได้นานกว่าสารรังสี  สารรังสีที่นิยมใช้ ได้แก่ Digoxigenin , Biotin , Fluorescein , Horseradish peroxidase , Alkaline phosphate เป็นต้น

                             วิธีที่นิยม คือ การติดฉลากที่ปลาย 3´ชนิด Homopolymer ซึ่งจะใช้คุณสมบัติของ TdT เช่นเดียวกัน

2.     การทำ DNA ที่ติดฉลากให้บริสุทธิ์

2.1    การตกตะกอนด้วย Ethanol

                             หลังจากการติดฉลาก DNA เรียบร้อยแล้ว เติม 3M Sodium Acetate 1/10 ของปริมาตรสารละลาย ตามด้วย Absolute Ethanol ในปริมาตร 2 เท่าของสารละลาย เขย่าให้เข้ากัน นำไปเก็บที่ -70°C เป็นเวลา 30 นาที แล้วจึงนำมาปั่นเก็บตะกอนที่ 12,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาที วิธีนี้ไม่เหมาะสมสำหรับการแยก DNA ติดฉลากที่เป็น Oligonucleotide เนื่องจาก DNA สายสั้นๆมักตกตะกอนไม่สมบูรณ์ ทำให้สูญเสียตัวติดตาม

2.2    การใช้คอลัมโครมาโทรกราฟฟี

                             วิธีนี้จะกำจัดนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากส่วนเกินออกจาก DNA ที่ติเฉลากไปแล้ว โดยได้ผลผลิตทั้ง DNA , RNA และ Oligonucleotide วิธีที่สะดวกที่สุดและรวดเร็วที่สุด คือ การใช้ Spun Column ที่บรรจุ Sephadex G-25

3.     การทำ Hybridization

                             คือ การกำหนดสภาวะให้ตัวติดตามที่ติดฉลากแล้ว สามารถเข้าจับเบสคู่สมกับ DNAเป้าหมาย โดยทั้งคู่จะถูกทำให้อยู่ในสภาพสายเดี่ยวมาก่อนที่จะตรวจสอบ มักนิยมให้ DNA เป้าหมายถูกตรึงอยู่บนกระดาษกรองพิเศษหรือ membrane filter ซึ่งมีคุณสมบัติจับ DNA สายเดี่ยวได้ดี ส่วน DNA ตัวติดตามจะอยู่ในสารละลาย แต่อาจกระทำในสภาวะที่อยู่ในสารละลายทั้งคู่หรือ membrane filter โดยตรงก็ได้
 

 ปัจจัยต่างๆที่เกี่ยวข้องกับการทำ Hybridization

        1. ส่วนประกอบของเบสบนตัวติดตาม

        2. อุณหภูมิที่ก่อให้เกิดการรวมตัวของ DNA สายเดี่ยวกลายป็นสายคู่

                                3. ความเข้มข้นของตัวติดตาม ( หากเจือจางเกินไปจะทำให้อัตราเร็วของการหลอมรวมกันเป็นไปได้ช้า หากเข้มข้นเกินไปอาจก่อให้เกิด Background ได้ )

        4. ความเข้มข้นและคุณสมบัติทางประจุของเกลือในสารละลาย  Hybridization

                          ปัจจัยต่างๆเหล่านี้จะส่งผลให้อุณหภูมิที่ใช้ในการ Hybridization แตกต่างกัน ซึ่งจะขึ้นกับคุณสมบัติของตัวติดตามเป็นหลัก

  ถ้าเป็นตัวติดตามขนาดสั้นกว่า 25 base อุณหภูมิจะขึ้นกับลำดับของ base

  Melting temperature (Tm ,° C) = 2(A + T) + 4(G + C)

                          ถ้าเป็นตัวติดตามขนาดยาวกว่า 25 base อุณหภูมิจะขึ้นกับปัจจัยที่กล่าวมาข้างต้น
                          Melting temperature (Tm ,° C) = 81.5 - 16.6(log[Na+]) + 0.41(%G + C) - (600/N)
                          N = จำนวน base ในสาย oligonucleotide

                          การทำ Hybridization ของ Oligonucleotide มักทำที่อุณหภูมิต่ำกว่า Tm ประมาณ 5 - 10°C เท่านั้น เพื่อให้การจับคู่ของเบสอยู่ตัวมากขึ้น

                4.     การตรวจจับหาตัวติดตาม

                        4.1 การตรวจจับสารรังสี

                          ประกบกระดาษกรองกับแผ่นฟิล์มเอ็กเรย์ เก็บไว้ที่ -70°C เป็นเวลา 16-24 ชั่วโมง จึงนำไปล้างและดูผลจุดสีดำที่ปรากฏ
 

 

รูปที่ 8 แสดงการเรืองแสงของแบที่ Complementary กับตัวติดตามที่ติดฉลากด้วยสารรังสี

 

 

รูปที่ 9 แสดงภาพที่เกิดบนแผ่นฟิล์มเอ็กเรย์

 

                        4.2  การตรวจจับสารปลอดรังสี

                          เป็นการตรวจหาสีหรือตรวจหาแสง ขึ้นกับชนิดของสารปลอดรังสีที่ใช้

                          เช่น สารปลอดรังสีเป็น biotin มักใช้  Streptavidin – alkaline phosphate conjugate เป็นตัวตรวจจับ และสามารถให้ผลเป็นตะกอนสีน้ำเงินม่วงเมื่อเติม NBT ( Nitroblue Tetrazolium ) และ BCIP ( 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate ) หรือให้ตะกอนสีแดงเมื่อเติม Fast Red ,

 TR Salt ( 4-Chloro-2-Methyl-Benzenediazonium Chloride ) และ NABP ( Naphthol-AS-B1-phosphate ) โดยการเปลี่ยนแปลงปฏิกิริยาของเอนไซม์ Alkaline Phosphatase ทำให้เกิดสีขึ้น

 

 

รูปที่ 10 แสดงการตรวจจับหาตัวติดตามด้วยสารปลอดรังสี

 

HOME

 

 

การศึกษา Genetic Mapping โดย STS – PCR

( Sequence – Tagged – Site PCR for Genome Mapping )

 

                การทำแผนผังของโครโมโซม ( Genome  Mapping ) ของสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆได้รับความสนใจ อย่างแพร่หลายจากนักวิจัย  เนื่องจากมีประโยชน์ต่อการศึกษาทางด้านพันธุกรรม  ทำให้สามารถที่จะเข้าใจ  Chromosome ได้ดีขึ้น  ถ้าได้แผนผังของโครโมโซม แล้วก็จะสามารถหาตำแหน่งของ Gene ที่ควบคุมลักษณะที่กำลังศึกษาอยู่ได้  ซึ่งสามารถที่จะใช้ Gene ตัวนั้นเป็นเครื่องหมายในการตรวจสอบความผิดปกติทางพันธุกรรมของมนุษย์ได้  งานทางด้าน Genome  Mapping นั้น  ได้มีการศึกษาทั้งในมนุษย์  สัตว์  และพืช   การทำแผนผังของ Chromosome ก็เริ่มด้วยการหาประชากร ( Population ) และตัวเครื่องหมาย  ( Marker ) ที่ใช้ในการทำแผนผัง ( Mapping ) ประชากรที่ใช้ในการทำแผนผังนั้น  ขึ้นกับสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด

 

ตัวเครื่องหมาย ( Marker )

                ตัวเครื่องหมายที่ใช้เป็นเครื่องหมายบนเส้น Chromosome ดังนั้นจึงเป็นสิ่งจำเป็นอย่างมากที่ต้องหาตัวเครื่องหมายให้มากเพียงพอที่จะครอบคลุมพื้นที่ของ  Chromosome ทุกเส้นในสิ่งมีชีวิตแต่ละสิ่งมีชีวิต  ในสมัยแรกเริ่ม  ของการทำแผนผังของโครโมโซมนั้น  ต้องอาศัยเครื่องหมายทางด้านสรีระ ( Morphology )ซึ่งเราสามารถที่จะวัดได้  จะเห็นได้ว่าลักษณะเหล่านี้มีจำนวนจำกัด  ทำให้ความพยายามในการทำแผนผังของ Chromosome ไม่เจริญรุดหน้าเท่าที่ควรการทำ Mapping นั้น  เริ่มแรกทำในแมลงหวี่ก่อน  โดยใช้ Morphology Marker พวกสีของตา  ลักษณะของปีกและอื่นๆ   ที่สามารถบอกความแตกต่างของแมลงหวี่แต่ละตัวในประชากร  ต่อมาความก้าวหน้าทางวิทยาการสมัยใหม่  โดยเฉพาะทางด้าน DNA Technology ทำให้นักวิจัยสามารถจะศึกษาโครงสร้างของ Chromosome ได้ละเอียดขึ้น  และสามารถเข้าใจว่า Chromosome ประกอบไปด้วย DNA และ Protein นั่นเอง  และทราบว่า Gene

 ( หน่วยที่ควบคุมลักษณะทางพันธุกรรม นั้นอยู่บนเส้น DNA ความเข้าใจเหล่านี้ทำให้งานทางด้าน Genome  Mapping ได้ก้าวหน้าไออย่างมาก  เนื่องจากนักวิจัยสามารถที่จะตรวจสอบความแปรปรวนที่ระดับ DNA ได้  จึงได้มีการใช้ DNA เป็นตัวเครื่องหมายในการทำแผนผัง Chromosome จะเห็นได้ว้าการใช้  DNA เป็นตัวเครื่องหมาย  ทำให้เรามีตัวเครื่องหมายในการทำแผนผัง  Chromosome ในจำนวนไม่จำกัด

 

การตรวจสอบ DNA  Marker

                การตรวจสอบความแตกต่างที่ระดับ  DNA  ในตอนนั้นทำโดยขบวนการ  Southern Blot Analysis  ซึ่งต้องใช้เวลามากและมีขั้นตอนหลายขั้นตอนหลายขั้นตอน  การตรวจสอบความแตกต่างของขนาดความยาวของเส้น DNA ที่ถูกตัดด้วย Restriction  Enzyme หรือเรียกกันอย่างแพร่หลายว่า RPLF ( Restriction  Fragment  Length  Polymorphism ) ต่อมาความก้าวหน้าทางวิทยาการตลอดจนการค้นพบ Enzyme ัตัวใหม่ คือ Taq DNA Polymerase ทำให้การศึกษา DNA มีความสะดวกและง่ายขึ้นโดยการใช้ PCR จากการนำเทคโนโลยีนี้เข้ามาใช้งานในงานวิจัยทางด้าน  Biotechnology ทำให้นักวิจัยทางด้าน Genome  Mapping ได้ให้ความสนใจและปะยุกต์เอา PCR มาใช้งานทางด้านการตรวจสอบความแตกต่างของ DNA ถึงแม้ว่า PCR จะมีประสิทธิภาพสะดวก  และรวดเร็วในการปฏิบัติ  อย่างไรก็ตามข้อจำกัดของการใช้ PCR ็ก็คือต้องอาศัย PCR Primer ในการทำปฏิกิริยา DNA Amplification ในปี ค..1990  Williums  และคณะ  จึงได้เสนอการใช้ Primer แบบสุ่มเพื่อแก้ปัญหานี้  Primer แบบสุ่มนี้ได้มาจากการออกแบบลำดับของเบส  แบบสุ่มความยาวประมาณ 8-10 Base  เขาให้ชื่อการทำ PCR โดยใช้ Primer แบบสุ่มนี้ว่า Random  Amplifiled  Polymorphic  DNA (RAPD)  แต่อย่างไรก็ตามปัญหาของ RAPD ก็คือความ Consistency ของการทำปฏิกิริยา

 

STS – PCR

                STS ( Sequence – Tagged-Site )นั้น  จริงแล้วถูกเสนอขึ้นโดย Olson และคณะในปี 1989 โดยความต้องการที่จะเปลี่ยน  Genetic  Map ไปเป็น Physical  Map ในมนุษย์ต่อมาการใช้ STS ก็ถูกนำมาประยุกต์ใช้กันอย่างแพร่หลาย  STS คือ DNA Sequence สั้นๆที่จะสามารถจำนำมาออกแบบเป็น PCR Primer ได้ STS สามารถจำนำมาได้จาก 2 แหล่งคือ

                1. จาก DNA Sequence ที่อยู่ใน GenBank หรือ Sequence ที่ตีพิมพ์แล้ว

                2. จากการทำ Sequencing ส่วนปลายสั้นๆของ DNA Clone

PCR Primer ที่อกแบบมาจาก STS สามารถจะนำมาใช้ทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณของ DNA ได้  และผลการทดลองนั้นจะมีความ Consistency สูงไม่แปรปรวนเหมือน RAPD

                การออกแบบ PCR  Primers จาก STS มีหลักการดังนี้

                1. ความยาวของ Primer ควรจะเป็น 18-25 Base

                2. ประกอบด้วย 50 % GC base ข้างใน Primer

                3. ไม่มี Inverted Sequence หรือ Repeated  Sequence  ใน Primer

ความแตกต่างของ DNA ที่ใช้วิธี STS – PCR มีข้อดีกว่าการใช้ Southern  Blot  Analysis ดังนี้

                1. สะดวกและรวดเร็ว

                2. สามารถจะบอกแบบความแตกต่างที่เห็นได้ทันทีว่าเกิดจาก  Point  Mutation หรือ           Insertion / Deletion

                3. ลดความยุ่งยากในการเก็บรักษา  DNA  Clone

                4. ลดความยุ่งยากและขั้นตอนการส่ง DNA Clone  จากประเทศหนึ่งไปยังอีกประเทศหนึ่ง

ความแตกต่างของขนาดของ DNA จาก STS-PCR  Product อาจทำได้โดย

                1. ตัด PCR  Product ด้วย Restriction  Enzyme และสังเกตความแตกต่างบน Gel Electrophoresis

                2. ใช้  Denaturation  Gradient Gel eleEtrophoresis

                3. ใช้  Oligospecific  Probe

                4. DNA  Sequencing  of  PCR Product

การใช้ STS-PCR สำหรับ Genome  Mapping ในพืชบางชนิด เช่น ข้าวบาร์เล่ย์  ยังช่วยให้ง่ายต่อการหาตำแหน่งของ DNA Marker  ว่าอยู่บน Chromosome ไหนได้ด้วยการใช้ STS-PCR ไปทำปฏิกิริยา กับ DNA  Template  ที่สกัดมาจาก Cytogenetic  Stock พวก Chromosome  Addition / Deletion  Line
 

คำนิยาม

DNA sequencing คือ วิธีการหาลำดับ Base ของ DNA ซึ่งสามารถที่จะทำได้หลายวิธีด้วยกัน

 

Genome คือ ชุดของ Chromosome ของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด เช่น Genome ของมนุษย์ ประกอบด้วย Chromosome 23 คู่

 

Genome Mapping คือ การทำแผนผังของ Chromosome ซึ่งกระทำได้โดยการใช้ตัวเครื่องหมาย  ( Marker )  ไป ทดสอบความแปรปรวนในประชากร ที่ใช้ในการทำแผนผัง

Marker คือ ตัวเครื่องหมายที่ใช้การทำแผนผังของ Chromosome ตัวเครื่องหมาย นี้แบ่งออกได้อย่างกว้างขวาง คือ

                          1. Morphlogical Marker คือตัวเครื่องหมายที่สามารถที่จะวัดได้โดยตรง หรือสังเกตได้ตรงเป็นลักษณะทางสรีระ เช่น สีของตา ผม สีของตา หรือลักษณะของตา เป็นต้น

                          2. Biochemical Marker คือลักษณะที่ตรวจสอบวัดได้โดยขบวนการทางชีวเคมี เช่น Protein Isoenzyme เป็นต้น

                          3. DNA Marker  เป็นเครื่องหมายที่นิยมกันอย่างแพร่หลายเพราะว่ามีความแปรปรวน

PCR ย่อมาจาก Polymerase  Chain  Reaction เป็นวิธีการเพิ่มปริมาณของ DNA ในส่วนเฉพาะเจาะจงบนเส้น Chromosome การเพิ่ม ปริมาณนี้ต้องการ DNA แม่แบบจำนวนเล็กน้อย ( DNA Template ) องค์ประกอบการสร้าง DNA ได้แก่ พวก Nucleotide, PCR Primers อาจจะเป็น RAPD หรือ STS และ Taq DNA Polymerase Enzyme การเพิ่มปริมาณ ของ DNA ก็ทำเป็นรอบๆโดยแต่ละรอบจะมี 3 ขั้นตอนคือ

                          1. Denaturation  คือการแยก DNA  Template ออกจากสายคู่ให้เป็นสายเดี่ยวๆโดยจะใช้ ความร้อนประมาณ 94°-95°C

                          2. Annealing  คือขั้นตอนในการให้ PCR  Primer ไปจับกับ DNA Template สายเดี่ยว  โดยการลดอุณหภูมิลงให้เหลือประมาณ                                     35-60°C

                          3. Extention  หรือ  Polymerization คือขั้นตอนที่ Taq DNA  Polymerase Enzyme จะทำงานโดยการนำเอา Nucleotides มาต่อเข้ากับ Primer  โดยดูจาก DNA Template ว่าจะเอา  Nucleotide ตัวไหนมาต่อ  ขั้นตอนนี้กระทำที่  72 °C  ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่ Taq  DNA Polymerase ทำงานได้ดีที่สุด

 

Restriction Enzyme คือ Enzyme ที่สามารถจะตัดเส้น DNA ให้ขาดที่ตำแหน่งเฉพาะเจาะจง  โดยดูจากลำดับของ Base  Pair ในเส้น DNA

RFLP หรือ Restriction Fragment คือความแตกต่างของขนาดความยาวของ DNA ที่ถูกตัดด้วย  Length  Polymerization  Restriction  Enzyme แล้วทำ Gel  Electrophoresis จากนั้นก็ถ่าย DNA จากแผ่น Gel ไปลงบนแผ่น Filter  โดยจะต้องแยก DNA ออกเป็นเส้นเดี่ยวก่อนที่จะถ่ายลงบนแผ่น Filter  จากนั้นก็จำนำแผ่น Filter ที่มี DNA อยู่ไปตรวจสอบ RFLP

Sequence – Taged - Site (STS) เป็นส่วนลำดับ Nucleotide สั้นๆของ DNA Clone ที่สามารถนำมาออก แบบให้เป็น PCR Primer ได้

 

HOME

 

 

เทคนิค  PCR  กับมิติใหม่ทางเทคนิคการแพทย์

 

                     วัตถุประสงค์ของการประยุกต์ใช้เทคนิค  PCR  เพื่อการชันสูตรโรค (Diagnostic application  of  PCR) ที่สำคัญ มี 2 ประการ  คือ

1.          ตรวจหาการมีอยู่  หรือ  การขาดหายไปของลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะที่สนใจ (Deletion of  the  Presence or Absence  of  Specific  Nucleotide  Sequence) เป้าหมายการตรวจได้แก่

                                1.1  เชื้อจุลินทรีย์ก่อโรค ( Pathogen )  เช่น  ไวรัส   แบคทีเรีย   เชื้อรา ฯลฯ

                                1.2  ความผิดปรกติจากการเกิด Translocation , Deletion ฯลฯ  เช่น  Philadelphia  Chromosome   ฯลฯ           

2.         ตรวจหาการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม (Deletion  of  Genetic  Variation ) ที่ทำได้ในปัจจุบัน  มีดังนี้

2.1     การตรวจวินิจฉัยทารกในครรภ์ก่อนคลอด ( Prenatal Diagnosis ) หรือการตรวจเบื้องต้น

       ( Screening)  หาความผิดปรกติทางพันธุกรรม  เช่น โรค  Thalassemia ,  Sickle  Cell Anemia  ฯลฯ

2.2     การชันสูตรหาความผิดปรกติที่มีสาเหตุจาก  Somatic  Mutation  เช่น  Oncogenes

2.3     การตรวจแยกชนิดของแอนติเจนบนเม็ดเลือดขาว ( HLA  Typing )

โรคสำคัญต่างๆ ในคนที่สามารถตรวจได้โดยใช้เทคนิค  PCR ร่วมด้วย  ซึ่งสามารถประยุกต์ใช้แล้วในปัจจุบัน  ได้แก่

 

1. โรคติดเชื้อ ( Human  Infections  Diseases )

                                  การใช้เทคนิค  PCR  เพื่อตรวจหาสารพันธุกรรม  ซึ่งอาจจะเป็น  DNA  หรือ  RNA ของจุลินทรีย์ก่อโรค  เป็นแนวทางใหม่ของการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ  สามารถใช้ตรวจจุลินทรีย์ก่อโรคทุกชนิดที่ได้เคยมีการศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์ของ  Genome ไว้แล้ว  ลำดับนิวคลีโอไทด์นี้ใช้เป็นประโยชน์สำหรับออกแบบ  Primer  ซึ่งจำเพาะต่อเชื้อโรคที่สนใจข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ของ  Genome เหล่านี้สามารถค้นหาได้จากเอกสารตีพิมพ์ผลงานวิจัยในวารสารต่างๆหรีอจาก Nucleotide  Database ซึ่งเป็นฐานข้อมูลคอมพิวเตอร์ที่เก็บรวบรวมทุกลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้มีผู้รายงานไว้

                                  การนำเทคนิค PCR  มาใช้จะสามารถช่วยแก้ปัญหาและอุปสรรคดังกล่าวเนื่องจากการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมแบบ  Exponential โดยเทคนิค  PCR  ใช้เวลาสั้นมากสามารถทดแทนวิธีการเพาะเลี้ยงซึ่งต้องใช้เวลาหลายวันหรือหลายสัปดาห์  ต้องการปริมาณสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยน้อยกว่าวิธีการอื่นๆมาก และที่สำคัญ  คือ เทคนิค PCR ช่วยทำให้สารพันธุกรรมที่เป็นเป้าหมายในการตรวจมีปริมาณหรือจำนวนโมเลกุลเพิ่มขึ้นก่อนที่จะทำการตรวจ  ในขณะที่วิธีการอื่นๆโดยทั่วไปจะตรวจสารเป้าหมายเท่าที่มีอยู่ตามปรกติในธรรมชาติโดยมิได้มีการทำให้ปริมาณเพิ่มขึ้น ปัญหาสำคัญที่อาจเกิดขึ้นในการใช้เทคนิค PCR คือ การปนเปื้อนข้ามกันของ DNA จาการทำ PCR ครั้งก่อนติดลงไปในการทำปฏิกิริยา PCR ครั้งใหม่ การปนเปื้อนนี้เกิดได้ง่ายและมักจะเกิดขึ้นในห้องปฏิบัติการทุกแห่งที่ใช้เทคนิคนี้ การปนเปื้อนดังกล่าวจะทำให้เกิดการอ่านผลผิดพลาด

 

2. โรคผิดปกติทางพันธุกรรม ( Genetic Defected Diseases )

โรคผิดปกติทางพันธุกรรมเกิดจากความผิดปกติของสารพันธุกรรมซึ่งแบ่ง Disorders ได้เป็น 3 กลุ่ม ดังนี้

1. โรคที่เกิดจากการผิดปกติของยีนเดี่ยว ( Monogenic Disorders หรือ Single Gene Disorders หรือ Mendelian Disorders )

2. โรคที่เกิดจากการผิดปกติของโครโมโซม ( Chromosomal Disorders )

3. โรคที่เกิดจากสาเหตุหลายประการ

 

3. โรคมะเร็ง ( Cancers )

ในการวิจัยค้นคว้าเรื่องมะเร็ง ( Cancer Research ) เทคนิค PCR มีบทบาทสำคัญอย่างยิ่งในการบ่งชี้การเกิดความผิดปรกติของมะเร็งและการเกิด Somatic Mutations แบบจำเพาะบน Oncogenes และ Tumor Suppressor Genes โรคมะเร็งชนิดแรกที่มีรายงานซึ่งใช้เทคนิค PCR คือ    โรค Chronic Myeloid Leukemia ( CML ) ในการบ่งชี้  Philadelphia  Chromosome หลังจากนั้นมาได้มีรายงานที่แสดงการประยุกต์ใช้เทคนิค PCR ในการตรวจบ่งชี้ Chromosomal Translocations ในโรคมะเร็งอื่น ๆ

การตรวจหาความผิดปรกติที่รู้จักกันดีแล้วบน Ras Oncogenes ในโรคมะเร็งหลายชนิดสามารถทำได้โดยเทคนิค PCR ในเนื้องอกหลายชนิด

การประยุกต์ใช้ประโยชน์ทางการแพทย์ของเทคนิค  PCR  ที่นอกเหนือจากด้านการวินิจฉัยโรค คือ การตรวจวิเคราะห์ชนิดของ  HLA   (HLA Typing)  ที่เกี่ยวข้องกับโอกาสการเป็นโรคบางชนิด ( Disease  Susceptibility ) เช่น  Insulin - Dependent  Diabetes , Rheumatoid  Arthritis  ยังมีความสำคัญอย่างมากในการคัดเลือกเนื้อเยื่อหรืออวัยวะที่ใช้ปลูกถ่ายข้ามคนโดยการตรวจชนิด  HLA ของผู้ให้ ( Donor ) และผู้รับ ( Recipients ) ช่วยให้สามารถเลือกเนื้อเยื่อหรืออวัยวะจากผู้ให้ปลูกถ่ายให้กับผู้รับมรความเข้ากันได้ถูกต้องมากยิ่งขึ้น

 

                การเพิ่มขยายสายพันธุกรรมด้วยเทคนิค PCR

                ในกรณีที่สายพันธุกรรมเป็น  DNA  สามารถทำลายการเพิ่มขยายจำนวนโดยเทคนิค PCR ด้วยปฏิกริยาลูกโซ่ของเอ็นไซม์  Taq DNA  polymerase  ได้ทันทีแต่สำหรับสารพันธุกรรมที่เป็น RNA  จะต้องผ่านขั้นตอนสังเคราะห์  cDNA  (complementary  DNA ) ดยใช้  RNA  เป็น

ต้นแบบ(template)ด้วยปฏิกิริยาของเอ็นไซม์ reverse  transcriptase  ซึ่ง primer  จะต้องออกแบบลำดับนิวคลีโอไทด์จับกับ  RNA  ต้นแบบทางปลาย  3´ จากนั้นจึงสังเคราะห์เพิ่มจำนวน DNA โดยใช้เอ็มไซม์  Taq  DNA  polymerase  ต่อไปจนครบตามจำนวนรอบ(cycles)ที่กำหนด

 

HOME

 

 

PCR เพื่อการพิสูจน์หลักฐาน และโบราณคดี  ( PCR in Forensic Science )

        

                ความก้าวหน้าทางด้าน DNA Technology ได้ถูกนำมาประยุกต์ใช้กับงานด้านนี้โดยตรง เนื่องจากคนแต่ละคนจะมีความแตกต่างกันตามส่วนต่างๆของ DNA จะมากหรือน้อยขึ้นอยู่กับความใกล้ชิดกันทางสายเลือด หรือความเป็นเครือญาติ  DNA นั้นมีอยู่ในเซลล์ทุกเซลล์ ดังนั้นเซลล์เนื้อเยื่อเส้นผมหรือคราบเลือดและน้ำอสุจิก็สามารถที่จะนำมาสกัดเอา DNA ออกมาวิเคราะห์ได้ แรกเริ่มนั้นการวิเคราะห์ความแตกต่างของ DNA ทำได้โดยวิธีการที่เรียกว่า Southern blot Analysis แต่วิธีการนี้ต้องการใช้ DNA ปริมาณมาก และ DNA ที่นำมาใช้ในการวิเคราะห์ต้องมีคุณภาพดีด้วย แต่ในการหาหลักฐานเหล่านนี้พบว่าเนื้อเยื่อที่เราได้มีปริมาณน้อยไม่เพียงพอต่อการสกัด DNA ปริมาณมากๆได้  หรือคุณภาพไม่ดีเพียงพอ ปัจจุบันได้มีเทคนิค PCR เข้ามาช่วยในการวิเคราะห์ความแตกต่างของ DNA  ข้อดีคือ การวิเคราะห์นั้นต้องการ DNA จำนวนเพียงเล็กน้อยก็เพียงพอกับการวิเคราะห์ อีกทั้งคุณภาพของ DNA ก็ไม่จำเป็นต้องดีมากนัก ดังนั้นเนื้อเยื่อที่มีอายุนาน หรือเก็บนาน ขนาดมัมมี่ของชาวอียิปต์ที่มีอายุหลายร้อยปี ก็สามารถนำมาใช้ในการสกัด DNA เพื่อทำการวิเคราะห์ได้

 

DNA จากหลักฐานคดีความ

1.       หลักฐานจากเสันผม

เส้นผมเป็นหลักฐานที่พบมากในคดีต่างๆ จากการศึกษาพบว่า DNA ส่วนมากจะอยู่ตรงส่วน

ที่เป็นรากผม และตรงบริเวณรอบๆ Sheath Cell

2.       หลักฐานจากคราบเลือด

หลักฐานจากคราบเลือดนี้จะมีการเจือปนมาก DNA สามารถที่จะสกัดออกมาได้จากเลือด

ในการทำ PCR บางครั้งเราไม่จำเป็นที่จะต้องสกัดเอา DNA ออกมาจากคราบเลือดเลยก็ได้เพียงแต่ใช้น้ำละลายเอาคราบเลือดออกมา และใช้สารละลายเลือดนั้นมาทำ PCR ได้โดยตรง

 

                การศึกษาทางด้านโบราณคดี

            การใช้ประโยชน์เช่น การค้นพบโครงกระดูก หรือเนื้อเยื่อที่ฝังตัวในหินเป็นเวลานาน ทำการศึกษาได้ว่าเนื่อเยื่อเป็นของคน หรือของสัตว์ที่เขาสงสัยได้

                สำหรับงานทางโบราณคดีนั้น การเก็บตัวอย่างมักจะต้องใช้สารเคมีบางอย่างเพื่อจะอนุรักษ์สภาพของตัวอย่างเอาไว้ เช่น Paraffin , Formalin , Wax บางครั้งตัวอย่างอาจจะอยู่ในสภาพ Section บน Slide แล้วย้อมสี เช่น Haematoxylin , Erosin สารพวกนี้มีผลต่อสภาพของ DNA ใน Cell และระหว่างการสกัด  DNA

 

HOME

 

 

การวินิจฉัยโรคไวรัสของพืชโดยเทคนิค PCR ( Plant Virus Diagnosis by PCR )
การนำเทคนิค PCR มาใช้ประโยชน์ในงานวิจัยทางโรคพืช ทำได้ทั้งงานวิจัยพื้นฐาน และงานวิจัยประยุกต์

 

งานวิจัยพื้นฐาน เช่น การโคลนยีนหรือบางส่วนของยีนของเชื้อสาเหตุโรคพืชจำพวกไวรัส เพื่อนำยีนหรือบางส่วนของยีนที่สังเคราะห์ได้มาวิเคราะห์หาลำดับเบส แล้วศึกษาข้อมูลพื้นฐานเกี่ยวกับยีนของเชื้อโรค

งานวิจัยประยุกต์ เช่น การสร้าง DNA ตัวตรวจ ( DNA Probe ) เพื่อใช้ในการตรวจวินิจฉัยโรคและตรวจลักษณะพันธุกรรมที่ต้านทานโรค

นักวิจัยทางไวรัสพืชได้นำเทคนิค PCR มาใช้ใน 2 แนวทางใหญ่ๆ คือ

1.      การผลิต DNA ตัวตรวจโดยใช้ PCR

ทำการทดลองกับโรคใบหงิกเหลืองของมะเขือเทศ มีสาเหตุมาจาก Tomato Yellow Leaf Curl Virus

( TYLCV ) ซึ่งจัดอยู่ในกลุ่ม Geminiviruses  ยีนของไวรัสเป็นชนิด DNA เส้นเดี่ยวขดเป็นวง นำมาใช้เป็นต้นแบบในการผลิต DNA ตัวตรวจโรคใบหงิกเหลือง ใช้เทคนิค Symmetric PCR สังเคราะห์ DNA ตัวตรวจจากยีนต้นแบบที่อยู่ในรูป plasmid DNA บริสุทธิ์ พร้อมกับนำไปติดฉลากตัวตรวจด้วยสารไร้รังสี Digoxigenin  ตรวจผลผลิต DNA ด้วยอะกาโรสเจลอิเลคโตรโฟรีซีส เพื่อให้ทราบขนาดและวัดปริมาณ DNA

2.      การตรวจหายีนของไวรัสจากตัวอย่างพืชโดยใช้ PCR

                วิธีนี้เป็นที่นิยมในการตรวจวินิจฉัยโรคพืชจากไวรัส เฉพาะอย่างยิ่งชนิดที่มีปริมาณไวรัสในต้นพืช อยู่น้อยมากนอกจากนี้ยังใช้ในการตรวจสอบหายีนบนโครโมโซมของพืชที่ได้รับการถ่ายยีน ( Transgenic Plant ) ตัวอย่างงานทดลองที่เกี่ยวข้อง ได้แก่

2.1    การเพิ่มปริมาณยีนของไวรัสในน้ำคั้นพืชด้วยเทคนิค PCR

ได้มีการทดลองเพิ่มปริมาณ Genomic DNA ของไวรัส  TYLCV  จากน้ำคั้นของใบมะเขือเทศที่เป็นโรค

ใบหงิกเหลือง เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา PCR ในการตรวจหาไวรัสในพืช

2.2    การตรวจสอบยีนบนโครโมโซมพืชเพื่อคัดเลือกพืชที่ได้รับการถ่ายยีนต้านทานโรค

ในงานทดลองปรับปรุงสายพันธุ์มะเขือเทศให้ต้านทานต่อโรคใบหงิกเหลืองที่เกิดจากไวรัส TYLCV นั้น ได้มีการถ่ายยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคไวรัส ให้กับมะเขือเทศโดยใช้ระบบการส่งต่อยีนด้วยเชื้ออะโกรแบคทีเรียม ( Agrobacterium  Mediated  Genetransfer ) ไปสู่โครโมโซมของมะเขือเทศที่เพาะเลี้ยงไว้ในอาหารสังเคราะห์ ( Tissue Culturing ) คัดเลือกมะเขือเทศที่ได้รับการถ่ายยีนไปเลี้ยงให้เป็นต้นที่มีระบบรากที่สมบูรณ์ และนำออกปลูกในดินเพื่อตรวจดูระดับความต้านทานโรคในแต่ละขั้นตอนที่ต้องตรวจสอบว่า มียีนอยู่บนโครโมโซมพืชหรือไม่

ประโยชน์ของเทคนิค PCR ในทางโรคพืช มิได้จำกัดอยู่เพียงการตรวจวินิจฉัยโรคเท่านั้น หากแต่ยังสามารถนำมาใช้ในงานวิจัยพื้นฐานที่เกี่ยวกับข้อมูลต่างๆบนยีนของไวรัสที่เป็นสาเหตุของโรค หรือการศึกษาการแสดงออกของยีน และงานอื่นๆ เพื่อนำมาประมวลและปรับใช้ให้เกิดประโยชน์ในการปรับปรุงพันธุ์พืชให้ต้านทานโรคหรือเพื่อการควบคุมโรคพืชได้ต่อไป

 

HOME

 

Real Time PCR

รูปที่ 11 แสดงลักษณะของเครื่อง Real – Time PCR

เป็นการทำ PCR ที่คำนวณหาปริมาณของ PCR - Product ได้ โดยวัดปริมาณการเรืองแสงของสารFluorescent ที่ติดอยู่ที่ปลาย 5´ ของ probe ซึ่งจะเรืองแสงได้เมื่อสาร Fluorescent หลุดออกจาก Probe แล้ว

 

                                                                     รูปที่ 12 กระบวนการของ Real-Time PCR
จากรูปที่ 12   R (สีฟ้า) คือ Reporter Dye ซึ่งเป็นสาร Fluorescent ติดอยู่ปลาย 5´ ของ Probe,   Q (สีเทา) คือ Quender Dye ติดอยู่ที่ปลาย 3´ ของ Probe ซึ่งเป็นสารที่ Reporter Dye ถ่ายทอดพลังงานมาให้ในขณะที่ Reporter Dye ยังติดอยู่กับ Probe ทำให้ยังไม่มีการเรืองแสงของสาร Fluorescent

ขั้นตอน

1.     Polymerization จะสังเคราะห์ DNA โดยมี Primer และ Probe ซึ่งได้ออกแบบลำดับเบสไว้แล้ว

2.     Strand Displacement เมื่อ DNA สายใหม่ถูกสังเคราะห์มาจนเริ่มแทนที่ Probe

3.     Cleavage เอนไซม์ 5´-3´ Nuclease ตัดสาย DNA ของ Probe ทำให้ Reporter Dye หลุดออกมาและเรืองแสง

4.     Polymerization Complete  เมื่อการสร้าง DNA  สายใหม่เสร็จสมบูรณ์ Probe  จะหลุดออกมาเป็นชิ้นเล็กๆ รวมทั้ง  Quender Dye  ก็จะหลุดออกมาด้วย
 

HOME